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紫外分光光度法測定黃瓜籽中總多糖、 總黃酮、總皂苷的含量
更新時間:2018-10-25 點擊次數:2913

黃瓜籽為葫蘆科植物黃瓜 Cucumber sativus L.的干燥 成熟種子?!吨腥A本草》中記載其具有續筋接骨、祛風、消 痰的功效,主治骨折筋傷、風濕痹痛、老年痰喘[1]。黃瓜籽 中富含有多種氨基酸、活性肽、蛋白質等物質,能維持人體 的骨代謝,調節鈣、磷代謝和骨容量,還具有聚集骨生長因 子及誘導骨生長因子分泌的作用。黃瓜籽中含有多種營養成 分,其中包含大量人體必需的脂肪酸、植物甾醇、糖和苷類、 揮發油以及多種無機鹽等 [2,3],但其所含總多糖、總皂苷及總 黃酮的含量尚未見報道。本研究采用紫外分光光度法對黃瓜 籽中以上三類物質的含量進行分析,為下一步藥理實驗提供 依據。為葫蘆科甜瓜屬植物黃瓜 (Cucumis sativ us L.) 的干燥成熟種子,使用前烘干并粉碎成粗粉。 葡萄糖對照品,批號 110833- 200503;牛血清白蛋白對照品, 批號 140619-200919;蘆丁對照品,批號 100080-201408;薯 蕷皂苷元對照品,批號 111539-200001;以上對照品均購自于 中國藥品生物制品檢定所。蒽酮、濃硫酸、乙醇、丙酮、正丁醇、石油醚等均為分析純,D101 大孔吸附樹脂(天 津市匯達化工)、考馬斯亮藍(天津科密歐試劑)等。 2 方法與結果 2.1 黃瓜籽多糖的提取與含量測定 2.1.1 多糖的提取 [4] 稱取黃瓜籽粗粉 100g,加 5 倍量 90% 乙醇加熱回流提取 3 次,每次 2 h,過濾,合并濾液, 濾液回收乙醇。濾渣揮干乙醇,加水煎煮 3 次,每次 2 h,合 并濾液,加熱濃縮至 60 ml,加 95% 乙醇調至溶液的乙醇濃度 為 80%,Sevage 法除蛋白后,于 4℃ 靜置過夜,抽濾,沉淀 依次以無水乙醇、丙酮洗滌,并于 60 ℃ 烘干,得到粗多糖 提取物。 2.1.2 黃瓜籽多糖的含量測定 2.1.2.1 標準曲線的制備 [5] 精密稱取 105℃干燥至恒重 的無水葡萄糖對照品約 10mg,置于 100ml 容量瓶中,加蒸餾表 1 膽酸線性范圍測定結果 濃度(mg/ml) 0.00677 0.0135 0.0203 0.0270 0.0338 吸收度 0.1430 0.2768 0.3915 0.5389 0.6732 線性方程為:y=0.00793+19.53x 相關系數 r=0.9994,測 定結果表明膽酸在 0.00677~0.6732mg/ml 濃度范圍內與吸收 度有良好線性關系。 4.3 討論 通過對牛黃清感膠囊的薄層色譜分析,可以很好地鑒別 人工牛黃。結果斑點清晰,陰性無干擾,專屬性強;利用工 作曲線法測定處方中人工牛黃的膽酸含量,為牛黃清感膠囊 質量的定量控制奠定了基礎。

水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得 0.10 g /L 的葡萄糖對照 品溶液。再取上述對照溶液適量分別加水配成 0,0.02,0.03, 0.04,0.06,0.08,0.10g/L 的 溶 液,分別吸取不同濃度溶 液1ml置 10 ml具塞試管中,每管各加入0.2% 蒽酮 - 硫 酸溶液 4 ml,待各管加完后同時搖勻,置于沸水中加熱 15min,取出后迅速置于冷水中冷卻至室溫,放置10min, 于 627nm 處測定吸光度,以葡萄糖濃度C為橫坐標,吸光 度 A 為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程 Y=0.0072X+0.0044 (R2=0.9992),表明樣品在 0.00 ~ 0.10g/L 范圍內線性關系 良好。 2.1.2.2 黃瓜籽多糖的含量測定 精密稱取干燥至恒重的黃 瓜籽粗多糖樣品 10mg,置于 100ml 容量瓶中,加蒸餾水溶解 并稀釋至刻度,搖勻,得濃度為 0.1 g/L的黃瓜籽粗多糖溶液。 精密吸取黃瓜籽粗多糖溶液 1.0 ml,按 2.1.2.1 項下方法測 定吸光度,由回歸方程計算樣品中總多糖含量。 2.1.3 結果 2.1.3.1 Sevage 法除蛋白結果 粗多糖樣品經Sevage 法 多次除蛋白,以牛血清白蛋白為對照品,通過考馬斯亮藍法 (UV,595nm) 測定殘留蛋白的含量,結果見表 1。 樣品處理 標準曲線方程 蛋白含量 % 除蛋白前 Y=0.0083X+0.0502 
(R2=0.9996)
33.18 第三次除蛋白 14.87 第五次除蛋白 14.51 第六次除蛋白 14.41 由表 1 可見,第五次、第六次除蛋白后樣品中殘留蛋白 含量分別為 14.51% 和 14.41%,含量變化不大,因此不再繼續 除蛋白。 2.1.3.2 粗多糖提取物性狀、提取率及含量 黃瓜籽粗多糖 提取物為白色粉末狀,得率為 4.59%。粗多糖提取物中多糖含 量為 23%,占生黃瓜籽的 1.06%。 2.2 黃瓜籽總黃酮含量測定 2.2.1 總黃酮提取物的制備 [6] 稱取黃瓜籽粗粉 500g,加 4 倍量石油醚于 50℃ 水浴中加熱回流提取 3 次,每次 2 h, 濾過,合并濾液,回收石油醚除去脂肪油部分,藥渣置通風 處放置揮干石油醚,加入 3 倍量 75% 乙醇溶液,加熱回流提 取 3 次,每次 2 h,濾過,合并濾液,減壓濃縮,將濃縮液 均分成兩份,冷藏一份備用。另一份加 100ml 蒸餾水混勻, 經大孔吸附樹脂 D101(已經預處理)分離純化,先用 3BV 蒸 餾水靜止吸附 24h,再依次加入 2BV 的 20% 乙醇洗脫、2BV 的 50% 乙醇洗脫、4BV 的 75% 乙醇進行洗脫,合并洗脫液,回收 乙醇 , 干燥即得總黃酮粗提物。 2.2.2 總黃酮的含量測定 2.2.2.1 標準曲線的繪制 [7] 精密稱取蘆丁對照品 0.1260g 置于 10ml 容量瓶中,加70%乙醇溶液使之溶解并定容至刻 度,搖勻,即得蘆丁對照品溶液。精密吸取蘆丁對照品溶液 0, 1, 2, 3, 4, 5 ml,分別置于 10ml 容量瓶中,加 0.05g/ml 亞硝酸鈉溶液 0.3ml,搖勻后放置 6min,加 0.1g/ml 硝酸鋁 溶液 0.3ml,搖勻后放置 6min,加 1.0mol/L 氫氧化鈉溶液 4.0mL,再用 70% 乙醇溶液定容至刻度,搖勻,放置 15min。 于 510nm 測定吸光度值,得到回歸方程為 Y=0.0115X-0.0094 (R2=0.9990),表明樣品在 0.00 ~ 0.756 g/L 范圍內線性關 系良好。 2.2.2.2 總黃酮的含量測定 精密稱取 2.2.1 處理好的總黃 酮樣品 0.5213g 于 10ml 容量瓶中,加 70% 乙醇溶解并定容至 刻度,搖勻,再準確吸取 1ml 溶液于 10ml 容量瓶中,按照標 準溶液制備方法進行實驗并測定吸光度。 2.2.3 結果 經上述制備方法得到的總黃酮樣品為1.0665g,得率為 0.43%。根據回歸方程計算提取物中總黃酮含量為 67.98%,占生藥量的 0.29%。 2.3 黃瓜籽總皂苷的提取分離及含量測定 2.3.1 總皂苷的提取分離[8] 取 2.2.1 中冷藏儲備樣品 17.97g加5倍體積的蒸餾水溶解,用乙酸乙酯萃取兩次,每 次 90ml,水層再用水飽和正丁醇萃取三次,每次 90ml,合并 正丁醇層,回收正丁醇,干燥即得黃瓜籽總皂苷提取物。 2.3.2 總皂苷的含量測定 2.3.2.1 標準曲線的繪制 [9] 精密稱定薯蕷皂苷元對照品約 3mg, 置于 10ml 容量瓶中 , 加甲醇溶解并定容,得到對照品 溶液。精密吸取對照品溶液 0,0.3,0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml 分別置于 10ml 容量瓶 , 揮干溶劑 , 加高氯酸至刻度,搖勻, 65℃水浴加熱顯色 15 min,取出后立即置于冰水浴中 15min 后停止反應,于 410 nm 波長處測定吸光度值。計算得回歸方 程為 Y = 8.348X+ 0.078(R2= 0.997),結果表明薯蕷皂苷 元在 0.0 ~ 0.3 g /L 范圍內與吸光度呈良好的線性關系。 2.3.2.2 樣品總皂苷的含量測定 稱取2.3.1 中得到的總 皂苷提取物0.3456g 于 10 ml 容量瓶中,加甲醇溶解并定 容,準確吸取 1ml 于 10ml 容量瓶中,同法制成樣品溶液并于 410nm 波長處測定吸光度。 2.3.3 結果 上述制備方法得到黃瓜籽總皂苷1.45g,提 取率為 0.58%,根據回歸方程計算得提取物中總皂苷含量為 30.22%,占生藥量的 0.18%。 3 討論 總多糖提取物中 , 常伴有無機鹽、蛋白質、色素及醇不 溶性小分子有機物 ( 如低聚糖 ) 等雜質 , Sevage 法是常用的 除蛋白方法。本研究經 6 次除蛋白后,殘留蛋白含量相對穩 定,可能是糖與蛋白形成糖蛋白復合物 , 使蛋白質的脫除更 加困難。黃瓜籽經提取分離得到的提取物中總黃酮含量達到 67.98%,說明此方法應用于黃瓜籽總黃酮的分離純化良好; 另一提取物中總皂苷含量為 30.22%,由于方法中采用溶劑萃 取法進行分離達不到更好地純化皂苷的作用,還需進一步通 過離子交換樹脂等方法進行純化。本實驗目的之一是為了檢 測黃瓜籽中總黃酮、總皂苷及總多糖的含量,三種物質中總 多糖的含量高,總皂苷的含量低,其次是得到各有效組 份提取物用于抗骨質疏松作用機理研究。 

 

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